荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是在常规PCR基础上发展起来的一种核酸定量技术。其核心原理基于荧光信号与PCR扩增产物量之间的对应关系，通过在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光标记物，实时监测反应过程中荧光强度的变化，从而对起始模板核酸的量进行定量分析。
(一)荧光标记方式
1.TaqMan探针法
-TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，其5'端标记有荧光报告基团(如FAM)，3'端标记有荧光淬灭基团(如TAMRA)。在未进行PCR扩增时，由于探针的完整性，荧光报告基团与淬灭基团空间位置接近，发生荧光共振能量转移(FRET)，荧光报告基团被淬灭，此时检测不到荧光信号。
-当进行PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针降解，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，荧光报告基团被激发后发出荧光，其荧光强度与扩增产物的数量成正比。随着PCR循环数的增加，扩增产物不断积累，荧光信号不断增强，通过检测荧光强度即可对模板核酸进行定量。
2.SYBR Green I染料法
-SYBR Green I是一种能够与双链DNA小沟结合的荧光染料。在PCR反应的变性阶段，SYBR Green I游离于溶液中，此时荧光信号较弱。
-在退火和延伸阶段，随着双链DNA的形成，SYBR Green I与双链DNA结合，其荧光强度会显著增强。由于荧光信号强度与双链DNA的含量相关，而双链DNA的含量又与PCR扩增产物的数量成正比，因此可以通过检测SYBR Green I的荧光强度来监测PCR扩增过程并进行定量分析。不过，SYBR Green I与非特异性双链DNA(如引物二聚体)结合也会产生荧光，所以需要通过熔解曲线分析来区分特异性扩增产物和非特异性产物。
(二)荧光定量PCR的原理
在PCR反应的指数增长期，扩增产物的量与起始模板核酸的量存在确定的数学关系。通过对荧光信号的实时监测，可以得到扩增产物的荧光强度随循环数变化的曲线。根据已知浓度的标准品制作标准曲线，将待测样品的荧光信号与标准曲线进行比较，就可以计算出待测样品中起始模板核酸的拷贝数或浓度，从而实现对核酸的准确定量。
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更新时间：2025-08-06 
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