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奥林巴斯单分子成像定位超分辨显微镜

更新时间:2014-08-14      浏览次数:3344

单分子成像定位超分辨显微镜

当前通过光活化或光开关及位置测定的超高分辨荧光成像使我们可以理解细胞功能如何在分子水平表达及编码。在近些年所有超分辨的成像技术中,定位显微镜独树一帜,因为它传达着单分子的分布、距离等信息。在分子水平直接产生实验反馈观察复杂的生理反应,另外有效的染料标识的出现可获得真实的分子水平的分辨率,这使得定位显微镜更加强大。

定义超分辨技术

传统光学显微镜在xy方向的分辨极限是250nm,z轴方向是>450-700nm。这个极限也被叫做点扩散函数PSF,是一个点的光通过显微镜被衍射后形成的固定尺寸,它也可以是量度的zui小尺寸的点光源或被显微镜可分辨的zui小物体。小于PSF的点被显微镜认为是与PSF相同的点。物体之间越接近于PSF宽度越不能被单独识别。通常PSF宽度是采用Rayleigh标准:R=0.61λ/NA,NA指数值孔径。任何克服了传统显微镜极限至少二者其一的技术都可被称作超分辨技术。需要指出的是,当显微镜需要分辨两个或者更多点光源的时候,很难突破光学分辨率的极限来进行定位.而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候,通过特定的算法拟合,此荧光分子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限,达到纳米级。

设备要求

定位显微镜搭载起来很容易,它需要一套宽场显微镜,同时搭载激光光源和激光耦合器,一套灵敏的CCD系统,还有有效的开源的软件算法,像奥林巴斯Olympus可以提供界面友好的集成的这样一套系统cell^TIRF,可作为多通道的多维的超高分辨单分子定位的检测平台,它拥有其*的技术优势和相关的配套系统以保证商业市场上可获得的zui高单分子检测级别的同步多色TIRF光学质量。其TIRF物镜是相关领域研究大牛的,实验条件通过实验管理界面很容易的控制。总的来说奥林巴斯的TIRF主打市场。

算法

定位显微镜确实需要图像处理的技术,基于高分辨重建图像,我们可以用下面开源的软件算法来进行模拟定位的计算:

  • Samuel Hess
  • Xiaowei Zhuang
  • Ricardo Henriques (QuickPALM plug in Image J)

标本准备

为了得到更好的分辨率的应用zui主要依赖于标本的制备,而zui小程度的是依赖于显微镜和算法,每个用户的应用需要找到适合自己标本的条件,比如:激光强度、照射时间、区域和重复次数、背景抑制、染料标注表达水平等因素。同时载物台的稳定性及Z轴的稳定性也是为了获得准确的数据而必须考虑的因素。

显微镜技术和细胞生物学的发展经常给我们带来戏剧性的跳跃,生物学家不再受限于仅仅从总体运动的可视的分子相互作用上进行推理,而是当他们剧烈作用时,可能看到单个的分子。超高分辨率显微镜可以给生物学家在一个全新的水平上研究细胞内部的工作状态。

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