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Cassification
随着科研水平的提高和实验技术的发展,人们对生命科学领域的探索也在不断深入。以前,人们依靠观察固定的组织标本,揭示了许多自然的奥秘,但是在科学技术高速发展的今天,科研人员希望在zui真实的条件下来观察活体细胞,研究细胞表面和内部的动态变化,甚至观察细胞内单分子的运动情况。
全内反射(total internal reflection)基本理论-Snells’ Law
全内反射现象是生活中的一种常见现象,如右下图所示 ,当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在两介质接触面一部分发生反射,一部分发生折射。入射角θ1和透射角θ2之间满足关系遵循Snells’ Law:
由Snells’ Law可知,若n1大于n2,由公式可以看出当入射角增大时,透射角也增大。假设增大到临界角θc时的透射角为90°。当光线以大于或者等于临界角θc入射时,入射光在界面处只发生反射而不再透射进n2介质,也就是发生了全反射。即 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
由上式可知,当n1大于n2时,全反射就可能发生。如果玻璃的折射率取为1.52,溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33~1.38),则玻璃/界面处的临界角为61.74°。即当光线从玻璃中射入溶液中时,入射角大于61.74°时就会发生全反射。
消逝波(Evanescent wave)与全内反射显微镜 (TIRFM)
从几何光学的角度来看,当发生全反射时,光会在玻璃界面上*反射而不进入液体溶液中。实际上,由于波动效应,有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中,平行于界面传播。这部分光就是所谓的隐失波。隐失波是一种非均匀波,它沿着入射面上的介质边界传播,在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。
全内反射荧光显微技术(TIRFM, Total Internal
Reflection Fluorecence Microscopy)又称为消逝波显微技术,是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光基团受到激发,因此几乎*排除了细胞体内的自发荧光干扰。与传统荧光照明技术相比,TIRFM技术极大的改善了图像的信噪比从而可以观察到样品表面甚至单分子的活动情况。
消逝波在生物成像应用中具有以下几点优势较低的光损伤
较低的光损伤
较高的Z轴分辨率 (80-300 nm)
高信噪比
荧光高对比度
对活细胞有较低的光漂白和光毒性
结合活细胞动力学研究的方案
WF, CLSM, SDCM and TIRF技术在Z轴分辨率和获取速度上的比较
该图为宽场照明(wildfield,WF)成像与TIRF成像的效果对比。由于TIRF模
式下细胞只有很薄的紧贴培养皿底部的部分荧光物质被激活,所以非常细小的结
构(如actin)由于信噪比(S/N)增加而显得特别清晰。
应用篇
TIRFM在生物学研究中的应用
1、膜相关的生物学研究
分子扩散的研究 (如 Sytaxin蛋白的研究)
转运动力学研究
膜融合研究
细胞通讯研究
细胞骨架动力学研究
2、囊泡运输
运输过程的研究
分子定位研究
胞吞胞吐研究
3、单分子荧光检测
TIRF应用示例1:微管动力学研究
生长的微管末端是许多重要蛋白暂时结合的平台,这些蛋白可以调节微管的动态及细胞亚结构间的相互作用。末端结合蛋白(End-binding proteins (EBs))可以自主的识别生长的微管末端的一个扩展区域,这个区域的结构特性是未知的,然后末端结合蛋白再募集其他因子到这个动态末端结构上。
TIRFM应用示例2:膜融合变化(胞吐)
细胞也需要输入和输出大分子,它的大小不能直接通过孔或转运蛋白跨膜转运。在真核细胞中,该过程是分别通过胞吞(Endocytosis)和胞吐(Exocytosis)来实现的。
胞吞和胞吐都涉及到一种特殊的脂囊泡的形成。受体介导的胞吞开始是大分子与细胞的质膜上的受体蛋白结合,然后膜凹陷,形成一个含有要输入的大分子的脂囊泡,也称为内吞囊泡,出现在细胞内。出现在胞内的囊泡与胞内体融合,然后再与溶酶体融合,胞吞的物质被降解。在胞吐中,细胞分泌出的蛋白质被包裹在囊泡内,然后与质膜融合,zui后将囊泡内的包容物释放到细胞外介质中。无论是胞吞还是胞吐过程,都有非常关键的一部分过程是发生在细胞膜上的,如下图所示神经递质的释放过程,突触小泡到达细胞膜区域进入消逝波范围,通过胞吐作用释放神经递质到突触后膜的过程可以完整的被记录到。
膜融合反应(胞吐)
- 囊泡研究关注质膜融合过程
- 胞吐过程非常迅速且信号微弱
- 高信噪比的TIRF技术成像可以捕捉该信号
该视频显示快速的膜融合过程,
在该反应过程中可以观察到许多囊泡破裂后快速的荧光增加过程,随后是缓慢的扩散。
TIRFM应用示例3:单分子定位超分辨率成像
超分辨率成像能够量化单分子在XY层面上达高于20nm的精度,下图显示神经内分泌细胞膜上单个蛋白分子的分布状态。
Dr. Colin Rickman, Heriot-Watt University
产品篇
系统核心优势一
Z-轴漂移补偿系统(ZDC):已经升级至第三代
连续模式:独立工作,与成像同步进行(100Hz取样率,每秒5次矫正)
高度:下至70纳米
特殊偏移透镜:同步Z-轴聚焦调节
高耐用度
系统核心优势二
微秒级系统实时控制器(RTC)
高速(100µs) ,高精度(<2µs) ,系统全模块并行实时协调控制ODB (Olympus Data Bus)数据总线,便捷稳定的通讯TTL数字信号同步输出/输入,可以方便搭载第三方产品可调模拟信号输出
系统核心优势三
实验管理器(Experiment Manager)
基于实施控制系统(RTC)
图像化编程
随意创建实验协议,直观便捷自动保存协议和数据
系统核心优势四
为什么在TIRF系统中,特别同步多色TIRF成像时,每个通道激光单独引入?
在同样的光学体系中,由于不同波长的光发生全内反射需要的临界角不同,如果所有的激光采用单个通道引入,则会造成不同的激光产生的消逝波深度( Penetration depth )不同,如图左侧所示,405nm和640nm的激光产生的消逝波深度分别为132nm和83nm,无法保证TIRF观察深度的一致性。
奥林巴斯Cell^TIRF系统,采用激光单独引入,zui多四通道独立控制,实线电动同步,能保证不同的激光消逝波深度保持一致,实现了空间定位的一致性和高的Z轴分辨率;如图右所示, 405nm和640nm的激光能够各自调整到相应的入射角度(67°和77°),保证TIRF观察深度在83nm。
针对用户的不同需求,OLYMPUS cell^TIRF有single line、2line、4line可供用户选择,通过不同的TIRF成像模式,均可以实现的TIRF成像。
系统核心优势五
OLYMPUS TIRF物镜种类丰富,分辨率,放大率,可选择性,!用户可根据自己的需求选择。
奥林巴斯全内反射荧光显微镜(TIRF)系统外观
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